図 2．免疫逃避に関わるウイルス由来タンパク質（図中の分子は例）の発現により，アロ免疫反応を抑制できる可能性がある．実験方法ヒ ト T 細 胞 は， 末 梢 血 単 核 球 を 抗 CD3 抗 体 に よ り 刺 激 し て 用 い た． 抗 CD3 抗 体 ( ク ロ ー ンOKT3) の単鎖可変領域フラグメントを CD8a 分子の膜貫通・細胞内ドメインと連結して HLA 陰性の白血病細胞株 K562 の細胞表面に発現させ，同時に共刺激分子 CD80 を導入することにより作製したK562-OKT3/80 と共培養することにより行った 5)．細胞培養は RPMI1640, 10% fetal bovine serum にサイトカイン IL-2 を 100 IU/ml，IL-15 を 10 ng/ml で添加して行った．CD19 に対する CAR 遺伝子は，クローン FMC63 由来の単鎖可変領域フラグメントに CD28, CD3z の細胞内ドメインを連結した第二世代 CAR を用いた．レトロウイルスプラスミド pMX に遺伝子を挿入して，PG13 パッケージング細胞に安定導入した上でウイルス液を産生させた．その他の遺伝子を発現させる際は，同一プラスミド内で P2A 配列により遺伝子を連結させることで導入した．レトロウイルスベクター導入は T 細胞刺激後に，レトロネクチン（タカラバイオ）を用いて行った．CRISPR/Cas9 による遺伝子ノックアウトは，Cas9 タンパク質と in vitro 合成ガイド RNA を混合して 37℃で 5 分間静置することで RNP 複合体を合成し，NEPA21 ( ネッパジーン ) を用いた電気穿孔法により T 細胞に導入した．ガイド RNA は以前に確立した配列を標的とした 6)．T 細胞の表面抗原及び CD107a 発現の解析はフローサイトメトリー (CantoII, BD Biosciences) により行った．細胞傷害活性は，標的細胞に EGFP 遺伝子を搭載しておき，共培養後に生き残る標的細胞をフローサイトメトリーによりカウントした．T 細胞と共培養を行っていない群をコントロールとして，これとの割合を計算することで，生細胞率を計算した．NK 細胞は，末梢血単核球から CD56 陽性細胞を磁気ビーズにより単離した後，K562 に膜型 IL-21と 4-1BBL を共発現させた細胞により刺激を加えて培養・増殖させた．サイトカインは IL-2, IL-15 を添加した．結果及び考察ウイルス由来の代表的な TAP 阻害タンパク質（UL49.5，US6，ICP47）を遺伝子レベルで CAR-T細胞に導入したところ，様々な程度で実際に T 細胞上の HLA 発現が阻害されることを確認した（図3）．最も抑制効果の高い ICP47 を以後の検討に用いることとした．― 187 ―
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