じるスプライジング異変の比較図 2. スプライシング因子変異により生100,000 細胞を用いて，R-loop を特異的に認識する S9.6 抗体を用いた CUT&Tag 法をおこなった．ポジティブコントロールとして H3K27me3，ネガティブコントロールとして 2 次抗体（IgG 抗体のみ）を用いた CUT&Tag も併せて行った．作成したライブラリーを次世代シーケンサーでデータ取得を行った．結果及び考察1. 異なるスプライシング因子変異による MDS の病態の比較解析MDS で同様に高頻度に変異を認める U2AF1 変異に関する条件的ノックインマウスの作製と解析を行った．非競合移植にて，U2af1 変異マウスは，血球減少と異形成，脾臓での無効造血をみとめ MDS を発症した（図 1）．造血幹細胞の RNA-seq にて，カセットエキソンの異常が最も認められ，よりスキップされたエキソンの 3’ スプライス部位の 3 塩基上流のコドンは T が多く占めており，U2AF1 変異タンパクでは 3’ スプライス部位直上が UAG モチーフの場合により exclude されやすくなると考えられた．Srsf2 変異と U2af1 変異でみられたスプライシング異常を比較解析した結果，U2af1 変異で特異的にスプライシング異常を示す標的遺伝子，および Srsf2 変異と U2af1 変異で共通してスプライシング異常を示す標的遺伝子を同定した（図 2）．図 1. U2af1 S34F 条件的ノックインマウス2. マウス造血細胞を用いた R-loop ゲノムワイドマッピング手法の確立R-loop のピークは，500,000 細胞，200,000 細胞スタートの時のいずれでも，TSS 領域を中心として検出された．さらに，RnaseH 処理によりこれらのピークが消失したことから，検出したピークはR-loop に特異的なピークであることを示している．100,000 細胞を用いた場合には，ピークの検出能は大きく低下した．ピークの分布は，細胞株での既報を再現するものであり，H3K27me3 抗体を用いた評価でも既報を再現する結果であった．R-loop のピークが検出されたゲノム領域の特徴をアノテーションすることにより，ピークはプロモーター領域に濃縮するほか，イントロン / 遺伝子間領域― 156 ―
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