ペプチドを合成，ウサギに免疫した．ELISA にて抗体形成を確認し，精製した抗体を用いて胎仔期マウス卵巣，および，卵巣オルガノイドにおいて免疫染色に用いた．結果及び考察（1） 胎児期卵形成における遺伝子発現のプロファイリング始原生殖細胞形成から出生後までの胎生期卵母細胞の網羅的な遺伝子発現解析の結果，胎仔期卵形成過程で活性化された遺伝子群は (i) 妊娠中期に一過性に活性化される遺伝子群，(ii) 妊娠中期から出生前にかけて発現のある遺伝子群，(iii) 妊娠後期から出生後にかけて発現上昇のある遺伝子群に大別することができた．またこれら遺伝子群の多くが ZGLP1 によって制御を受けることも明らかになり，ZGLP1 によって減数分裂，RNA 制御，クロマチン・転写制御，トランスポゾン抑制，卵胞形成などの卵形成プログラムの基盤を構成する遺伝子群が活性化されることが明らかになった．（2） 標的遺伝子の遺伝子改変 ES 細胞作製，in vitro 卵形成による表現型解析卵形成過程における機能が未知の遺伝子に着目して，Mouse CRISPR KO pooled library (Brie) を元にゲノム編集を行い，遺伝子破壊 ES 細胞株を作製した．標的遺伝子の中には欠損マウスにおいては生殖系列以外の器官発生異常による胚性致死または生後致死をきたす遺伝子も含まれているが，それら遺伝子のノックアウト ES 細胞株は正常に樹立でき，始原生殖細胞への誘導にも異常は観察されなかった．これは胚性致死により表現型解析が難しかった遺伝子群の生殖系列における機能検証を行うために，in vitro 誘導系が有用であることを示す結果である．遺伝子改変 ES 細胞株から誘導した始原生殖細胞を用いて卵母細胞誘導を行い，Stella-ECFP を指標に卵母細胞の形成および成長を観察したところ，標的遺伝子群の中には，欠損させると卵形成に顕著な異常をきたす遺伝子が含まれていることが明らかになった．培養系における卵母細胞の顕著な喪失は培養 6 〜 13 日目（マウスにおける妊娠中期から出生直前にあたる胎齢 11.5 〜 18.5 日に相当）にて起きていたため，培養 5，7，9 日目にて細胞を回収して遺伝子発現解析を行った．遺伝子破壊によって変動のあった遺伝子群はクロマチン制御，転写後 RNA 制御，レトロトランスポゾン制御，減数分裂機構の制御，タンパク質の維持機構などのプロセスに関与することが明らかになった．顕著な卵形成異常が確認された新規遺伝子群に対しては，新たな抗体の作製，3xFLAG-HA タグを挿入した ES 細胞株の作製を行い，ChIP-seq やIP-Mass Spec などを通した更なる分子機序の解明を進めている．また，遺伝子破壊した標的遺伝子群の中には，二次卵胞の形成までには顕著な表現型を示さない遺伝子も見つかったが，母型エピゲノムの構築など，卵形成自体には必須でなくとも次世代個体の正常な発生に必須のプロセスに関わっている可能性もあるため，それら遺伝子群に関しては，母型インプリントの獲得，卵子成熟，胚盤胞発生，個体発生，胎盤形成，などに着目して解析を進めている．In vitro 卵子誘導系を用いて行った機能スクリーニングによって，(i) 性決定後の生殖細胞の早期喪失，(ii) 減数分裂進行の異常，(iii) 原始卵胞形成の阻害，(iv) 卵母細胞数の増減を制御する卵形成必須遺伝子を新たに同定することができた．新規遺伝子の多くが ZGLP1 によって直接制御されることから，ZGLP1 による雌性性決定直後から卵形成を構成する複数の機能モジュール（減数分裂期相同組換え形成，細胞周期，品質管理チェックポイント，レトロトランスポゾン制御，卵胞形成・成長，母型エピゲノム構築）が連動して活性化されていることを示唆している（図 1）．― 119 ―
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