た． そのような中で，2019 年，ALS/FTD 患者の凍結脳組織から，TDP-43 陰性の神経細胞核をfluorescence-activated cell sorting (FACS) を利用し，集積する方法が考案され，全細胞核の約 2% しかない，TDP-43 陰性神経核の遺伝子発現状態 ( トランスクリプトーム ) が解析可能となった 4)．申請者は，このトランスクリプトームから，TDP-43 が消失した神経細胞核で，ALS/FTD の病態に関わる UNC13A の異常スプライシングが増加していることを見出した 5)．本方法を用いる事により，単一の TDP-43 陰性神経核で，DNA のメチル化状態 ( メチローム ) を，トランスクリプトームとともに解析できれば，細胞レベルで，本症の病態を明らかにできると考えた．しかし，これまで，同一細胞で，メチロームとトランスクリプトームを対応させることは大きな課題であった．そのような中，snmCAT-seq (single-nucleus methylcytosine, chromatin accessibility and transcriptome sequencing) 法が開発され，RNA 分子に「タグ」付けすることで，同一細胞核から，DNA と RNA の分子情報を同時に測定できるようになった 6)．これらの背景に基づき，私は，孤発性 ALS 発症の早期分子病態を，細胞レベルで解明することを目指した．実験方法ALS 患者由来の前頭葉組織 ( 凍結剖検脳組織 ) を使用して，TDP-43 陰性及び陽性の神経細胞核を集積した．方法としては，まず，ヒト凍結脳組織から，ショ糖密度勾配遠心法により，核を分離し，Alexa Fluor 488 共役型抗 -NeuN 抗体 ( 抗神経核抗体 )，Alexa Fluor 647 共役型抗 -TDP-43 抗体と核染色 DAPI を利用した細胞ソーティング (FACS Aria Ⅱ , BD) により解析を行った．結果及び考察最初に，Alexa Fluor 488 共役型抗 -NeuN 抗体 ( 抗神経核抗体，Millipore) と核染色 DAPI を利用した細胞ソーティング (FACS Aria Ⅱ , BD) により，神経細胞と非神経細胞の核を分離し，核酸抽出できることを確認した （図２）．図 2. ヒト脳組織からの神経細胞核と非神経細胞核の分離― 104 ―FACS ソーティングにより，NeuN 陽性細胞集団と NeuN 陰性細胞集団を分けて集積．各細胞集団から，RNA を抽出し，qPCR により神経細胞マーカーである NeuN と MAP2，グリア細胞の一つ，オリゴデンドロサイトのマーカーである MBP の発現を評価．NeuN 陽性細胞では，NeuN と MAP2 の発現を，NeuN 陰性細胞では，MBP の発現を確認．
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