が観察された．Smc3ヘテロマウスは，コルネリア・デ・ランゲ症候群の症状で見られる不安関連行動の増加を示した．このように，神経細胞におけるコヒーシンは，クロマチンループ形成制御を介して遺伝子発現を調節することによって，神経ネットワーク形成に寄与しており，コヒーシンの欠損は高次脳機能障害につながることがわかった (図1)．実験方法1. 発生期の中枢神経系におけるコヒーシンの発現1-1. 組織免疫染色コヒーシンサブユニットのひとつであるSmc3の発生期脳における発現を，組織免疫染色により検証する．妊娠12, 14, 16, 18日目のマウスから胎児を摘出し，4% PFA中で脳を取り出した．摘出した脳は4% PFA中で一晩浸漬固定した．脳組織を30% sucrose液中に浸漬後，凍結ブロックを作成し，クライオスタットで薄切して厚さ20 μmの切片とした．脳切片はスライドガラスに貼り付け，乾燥後，0.1% Triton X-100, 5% Bovine serum albumin (BSA) / PBS中に浸漬した．その後，抗Smc3抗体 (ウサギ由来ポリクローナル抗体)を1次抗体として用いて4℃, 一晩染色した．続いて，2次抗体として，Alexa 568 Goat anti Rabbit IgGを用いて，室温, 1時間染色した．封入後，蛍光顕微鏡下で観察し，各発生段階におけるSmc3の発現を検証した．1-2. Real-time PCR胎生期～成体までの各発生段階におけるSmc3の発現をReal-time PCR法によって定量的に評価する．マウス大脳皮質よりRNAを抽出し，cDNAを作成，Taq-Man probeを用いてReal-time PCRを行った．2. コヒーシン欠損マウスの作成Cre-LoxPシステムを用いて，Smc3のコンディショナルノックアウトマウスを作成した．Smc3のexon 1, 2の両端にloxP配列を挿入したSmc3 Flox/Floxマウスを作出した．全身でSmc3を欠損させるために，全細胞でCreリコンビナーゼを発現するCAG-Creマウスを用いた．神経細胞特異的なSmc3欠損マウスを作成するために，神経細胞にCreリコンビナーゼを発現するtau-CreマウスとSmc3 Flox/Floxマウスを交配した．得られたtau-Cre; Smc3 +/Floxマウス (ヘテロ欠損マウス)と，Smc3 Flox/Floxマウスを交配し，tau-Cre; Smc3 Flox/Flox マウス (ホモ欠損マウス)を作出した．3. コヒーシン欠損マウスの組織解析コヒーシン欠損マウスの大脳皮質の層構造をNissl染色によって検証した．胎生期～成体までの各発生段階で，野生型マウス，Smc3 +/-マウスを4% PFAで灌流固定を行い，脳組織を摘出した．摘出した脳は4% PFA中で一晩浸漬固定した．脳組織を30% sucrose液中に浸漬後，凍結ブロックを作成し，クライオスタットで薄切して厚さ20 μmの切片とした．脳切片はスライドガラスに貼り付け，乾燥後，Nissl液で染色し，観察した．― 241 ―
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