抗体（BioLegend Cat# 212720）を用いて細胞を染色し，FACS Jazzセルソーター（ベクトンディッキンソン）にて実施した（Nakai et al., STAR Protoc 2021）．RT-PCR解析のために，培養した細胞からISOGEN（ニッポンジーン）を用いてRNAを抽出し，SuperScript IV（Invitrogen）を用いた逆転写反応によってcDNAを合成した．cDNAをSYBR Greenマスターミックス（Roche）を用いた定量的PCR解析（LightCycler, Roche）に供し，遺伝子発現量を解析した．線維化関連遺伝子の探索のために，レンチウイルスにパッケージングされたマウス遺伝子に対するshRNAライブラリー（Vector Builder）をポリブレンを用いてReplic細胞に導入した．マウス腎障害モデルの解析C57black/6系統の野生型マウスの片側尿管を結紮・切断し，片側尿管結紮による水腎症モデルを作出した11,13)．施術後7，10，14日目に障害腎および対側腎のRNAを採取し，RT-PCR解析を実施した．組織の一部をホルマリン固定し，パラフィン切片のElastica-Masson染色により，尿細管障害を評価した14,15)．図2. Replic細胞結果及び考察Replic細胞の分化と腎線維化REP細胞は尿細管の間隙に存在する線維芽細胞の一種であり，PDGF受容体やCD73（5’-nucleotidase）を細胞表面に発現することが知られているが1,16)，これらの発現はREP細胞に対する特異性が低い．そこで，Epo遺伝子の発現制御領域下でCre組換え酵素を発現するトランスジーンを用いて，REP細胞において蛍光タンパク質tdTomatoを恒常的に発現する遺伝子改変マウスを樹立し，REP細胞の単離解析に用いている1,17,18)．Replic細胞は，tdTomato発現を指標として単離したREP細胞由来の細胞株であるため，すべての細胞が赤色蛍光を安定して発現する（図２）12)．Replic細胞は，平滑筋アクチン（Acta2）やコラーゲン（Col1a1やCol1a3など）などの筋線維芽細胞様の遺伝子発現様式を示すことから，培養中にREP細胞が筋線維芽細胞へと形質転換した細胞であると考えられる12)．一方，一部の細胞がCD73発現を維持しており，元の線維芽細胞の性質を残していることがわかっている．そこで，細胞表面におけるCD73の発現レベルが異なるReplic細胞を分取し，遺伝子発現を比較した．その結果，CD73の発現レベルが高いほど，筋線維芽細胞や腎線維Replic細胞は赤色蛍光タンパク質tdTomatoを恒常的に発現する．また，CD73陽性と陰性の細胞が混在する．― 228 ―
元のページ ../index.html#230